說明書-氪爾美-一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒.pdf

【產品概述】

細胞發生凋亡時，會激活一些DNA內切酶，這些內切酶會切斷核小體間的基因組DNA，產生180 bp-200 bp的DNA片段，表現為瓊脂糖凝膠電泳中呈現的特異的梯狀Ladder圖譜。基因組DNA雙鏈或單鏈斷裂時會出現產生大量的粘性 3’-OH未端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)的催化作用下，與YF-dUTP結合，從而通過熒光顯微鏡或流式細胞儀直接進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸未端轉移酶介導的缺口末端標記法(Terminal-deoxynucleotidyI transferase mediated nick end labeling,TUNEL)。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3’-OH形成，很少能夠被染色。Tunel法可以對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確地反應細胞凋亡典型的生物化學和形態特征，可檢測出極少量的凋亡細胞，因而在細胞凋亡的研究中廣泛采用。本試劑盒應用范圍廣，可用于檢測冷凍或石蠟切片中的細胞凋亡情況，也可檢測培養的貼壁細胞或懸浮細胞的凋亡情況。可選擇性的檢測凋亡細胞，而非壞死細胞或因輻照和藥物治療而造成的DNA鏈斷裂的細胞。本試劑盒檢測細胞凋亡，耗時短，只需一步染色反應，洗滌后即可檢測。

【需自備材料】

①PBS緩沖液(1x,PH值約為7.4) ②0.4%Triton X-100(PBS配制) ③0.1%Triton X-100(PBS配制，其中含5mg/mL BSA) ④4%多聚甲醛(PBS配制) ⑤免疫組化筆 ⑥脫蠟溶劑(石蠟切片樣本) ⑦石蠟切片處理相關試劑 ⑧抗熒光淬滅封片劑 ⑨ddH2O

【實驗設計】

A.陽性對照：DNase I處理制備陽性對照載玻片。DNase I可以消化單鏈或雙鏈 DNA暴露3’-OH末端，人為造成細胞凋亡。每次實驗做一次即可。(用來驗證本次實驗操作和試劑盒有無問題)

B.陰性對照：使用不含TdT Enzye的TUNEL Reaction Buffer，用ddH2O替代 TdT Enzyme。(主要是排除細胞自身凋亡、操作過程等原因導致的非特異性染色；以及調整拍攝曝光強度。)

C.實驗處理組：實驗組按照說明書正常操作。

D.實驗對照組：實驗組按照說明書正常操作。

【使用方法】

一、樣本準備

1. 對于貼壁細胞或細胞涂片

（1）PBS清洗1次。

注：如果擔心細胞涂片的細胞貼得不牢，可以干燥樣品使細胞貼得更牢。

（2）固定：加入適量4%多聚甲醛(PBS配制)，4℃固定30min。PBS清洗2次。

（3）通透：加入適量0.4%Triton X-100(PBS配制)，室溫通透20min。PBS清洗2次。

（4）轉步驟二，TUNEL反應。

2. 對于懸浮細胞或細胞懸液

（1）收集細胞(3-5x106個細胞)，1000rpm離心 5min，PBS清洗2次。

（2）固定：加入適量4% 多聚甲醛(PBS配制)，充分重懸細胞，4℃固定30min。2000rpm離心 5min，PBS清洗2次。

（3）通透：加入適量0.4% TritonX-100(PBS配制)，室溫通透20min。2000rpm離心5min，PBS清洗2次。

（4）轉步驟二，TUNEL反應。

3. 石蠟組織切片

（1）將石蠟切片置于切片架上，放置于60℃烘箱中烤片60min。

（2）脫蠟與水化：將切片樣本依次放入二甲苯I (10min) → 二甲苯II (10min) → 100%乙醇I (5min) →100%乙醇II  (5 min) → 95%乙醇 (5min) → 90%乙醇 (5min) → 80%乙醇 (5min) → 70%乙醇(5min)  → ddH20沖洗5min，沖洗2次。

注：二甲苯有毒，易揮發，請在通風櫥中進行此操作。

（3）用濾紙吸干切片樣本周圍液體，用免疫組化筆圈好樣本輪廓，以便下游通透與標記。

注：若在后續實驗操作中發現免疫組化筆畫的輪廓圈被破壞，需及時補畫。

（4）通透：按1:50的比例，將2mg/mL的 Proteinase K溶液用 PBS稀釋至終濃度40 ug/mL，在每個樣本上滴加100 uL，使溶液覆蓋全部樣本區域，37℃孵育30min。

注：Proteinase K可通透細胞膜和核膜，從而使后續步驟的染色試劑充分進入細胞核進行反應，提高標記效率。孵育時間過長會增加組織切片在后續洗滌步驟中從載波片上脫落的風險，過短則可能造成透性處理不充分，影響標記效率。為得到更好的結果，Protginase K的濃度、孵育時間、溫度需根據不同類型組織樣本進行優化。

（5）將切片樣本浸入1xPBS漂洗三次，每次5min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣本放在濕盒中保持濕潤。

注：這一步必須把 Proteinase K洗滌干凈，否則會嚴重干擾后續的標記反應。

（6）轉步驟二，TUNEL反應。

4. 冰凍組織切片

（1）固定：取出冰凍切片，并回溫至室溫。將切片樣本浸入4%多聚甲醛(PBS配制)中，室溫固定30 min。將切片樣本浸入1xPBS漂洗三次，每次10min。

注：若是擔心甲醛清洗不干凈，影響最終染色效果。可在甲醛固定完成后加入適量2mg/mL 甘氨酸清洗10 min，中和殘留的固定液，再進行PBS清洗。

（2）用濾紙吸干切片樣本周圍液體，用免疫組化筆圈好樣本輪廓，以便下游通透與標記。

注：若在后續實驗操作中發現免疫組化筆畫的輪廓圈被破壞，需及時補畫。

（3）通透：按1:50的比例，將2mg/mL的 Proteinase K溶液用PBS稀釋至終濃度 40 ug/mL，在每個樣本上滴加100 uL，使溶液覆蓋全部樣本區域，37℃孵育20min。

注：Proteinase K可通透細胞膜和核膜，從而使后續步驟的染色試劑充分進入細胞核進行反應，提高標記效率。孵育時間過長會增加組織切片在后續洗滌步驟中從載波片上脫落的風險，過短則可能造成透性處理不充分，影響標記效率。為得到更好的結果，Proteinase K的濃度、孵育時間、溫度需根據不同類型組織樣本進行優化。如優化 Proteinase K的濃度與孵育時間仍無法改善染色效果，可選擇將樣本浸入1% Triton X-100(PBS配制)中，室溫促滲3-5 min；之后將切片樣本浸入1xPBS漂洗三次，每次5min。

（4）將切片樣本浸入1xPBS漂洗三次，每次5min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣本放在濕盒中保持濕潤。

注：這一步必須把 Proteinase K洗滌干凈，否則會嚴重干擾后續的標記反應。

（5）轉步驟二，TUNEL反應。

5. 陽性處理 (僅陽性對照進行此步驟，其他樣品直接進行TUNEL反應步驟)

（1）按1:10的比例用ddH2O將10 x DNase I Buffer稀釋成1 x DNase I Buffer備用。

（2）滴加100uL 1 x DNase I Buffer到已處理的樣本上，覆蓋全部樣本區域，室溫平衡5min。

（3）用1 x DNase I Buffer以1:100稀釋DNase I (2U/uL)至終濃度20U/mL的工作液。

（4）棄去Buffer，加入100uL濃度為20 U/mL的DNase I工作液，室溫孵育15min。

（5）棄去DNase I工作液，PBS清洗2次。

（6）轉步驟二，TUNEL反應。

二、TUNEL 反應

1. 配制TUNEL反應液 (即用即配)

2. 對于貼壁細胞、細胞涂片或組織切片

（1）每個樣本加入50uL TUNEL反應液，使反應液均勻覆蓋樣本。37℃避光孵育適宜的時間 ( 細胞

推薦染色時間15-30 min，組織染色時間推薦1h )。

注：50 uL TUNEL 反應液適合涂片、切片或96 孔板 (其他不同孔板可以適當調整 TUNEL反應液體積，覆蓋細胞即可)。如果待檢測的樣品為涂片、切片或在24孔板、12孔板或6孔板中，可以使用防蒸發膜，或自行嘗試使用自封袋或者其它適當材料自行裁剪成比孔略小的圓形塑料片，滴加 TUNEL反應液后覆蓋在樣品上，可以防止 TUNEL反應液蒸發，并且使 TUNEL反應液均勻覆蓋樣本。

（2）棄去TUNEL反應液，PBS清洗2次后，再用0.1% Triton X-100 (PBS配制，其中含5mg/mL BSA)清洗 3次，每次5min，這樣游離的未反應的標記物可以清除較干凈。

（3）(可選) 每個樣本加入適量濃度為5ug/mL的DAPI染液，室溫避光孵育5min。染色完成后，棄去DAPI染液，PBS清洗2次，每次5min。

（4） (可選) 切片封片：每個樣本滴加20uL抗熒光淬滅封片劑 (抗熒光淬滅封片劑可能會不適用于某些染料，實驗前建議進行預實驗測試匹配性)，蓋上蓋玻片，用鑷子的鈍端輕輕敲擊蓋玻片，去除氣泡以使封片完全。

（5）用濾紙吸去多余的液體，向樣本區域加100 uL PBS保持樣本濕潤，立即在熒光顯微鏡下觀察。

3. 對于懸浮細胞或細胞懸液

（1）每個樣本管加入50uL TUNEL反應液輕輕重懸細胞，37℃避光孵育 15-30 min。每隔10 min用微量移液器輕輕重懸細胞。

（2）2000 rpm離心5min，棄去 TUNEL反應液，用0.1% Trton X-100 (PBS配制，其中含5mg/mL BSA)清洗2次，每次5min，這樣游離的未反應的標記物可以清除較干凈。

（3）每個樣本管加入100 uL濃度為5 ug/mL的DAPI染液，室溫避光孵育5min。

（4）加入400 uL PBS重懸細胞，立即用流式細胞儀檢測或進行涂片后在熒光顯微鏡下觀察。

【注意事項】

1. 熒光染料均存在淬滅問題，保存和使用過程中請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2. TUNEL Reaction Buffer使用時請佩戴口罩、手套，接觸皮膚后，請立即用大量水沖洗。

3. 使用前請將產品瞬時離心至管底，再進行后續實驗。使用前請將產品瞬時離心至管底，再進行后續實驗。

4. 染色背景較重或非特異性著色明顯時可適當減少染色時間。

5. 實驗時建議增加陰性對照和陽性對照組。

6. 本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。

7. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

【常見問題】

1. 為什么出現了一些非特異標記？

（1）有些細胞，比如平滑肌核酸酶或聚合酶活性水平較高，使得 DNA全部被切斷，易導致假陽性。建議：取出細胞后要立即固定并充分固定，以阻止這些酶的活性，同時設置陰性對照。

（2）固定液濃度過高或過低，導致中心部分細胞固定效果不佳，而使得中心部細胞自溶、DNA鏈出現不規則斷裂，產生假陽性。建議：推薦使用4%多聚甲醛。

（3）TdT 酶反應時間過長或 Tunel反應過程中反應液發生蒸發或滲漏，細胞表面不能保持濕潤。注意控制反應時間，并確保 TdT酶反應液能很好地覆蓋樣品。

（4）有些試劑或細胞存在自發熒光，選擇染料時要避開自發熒光的顏色。

2. 為什么沒有染上熒光？

（1）固定不充分。固定液首選4%多聚甲醛，現用現配。不建議使用乙醇，乙醇固定液的滲透力較弱，影響TUNEL標記效率。

（2）細胞膜和核膜的通透不充分，TdT酶末能到達核內。細胞可用0.2% Triton X-100溶液通透 5-30 min，不同的細胞所需要的通透時間略有不同，適當調整。

（3）延長標記時間至2h，并適當增加TdT酶及dUTP的用量。

（4）確定實驗對象細胞有凋亡。準備一份DNase I處理的陽性對照，驗證TdT酶反應是否正確進行。

3. 如何對細胞核進行復染？

可在TUNEL反應結束后對細胞核進行染色。

4. 為什么熒光背景高？

（1）支原體污染：可以使用支原體檢測試劑盒驗證。

（2）TdT 酶反應時間過長，可以用試劑盒提供的 TdT酶稀釋液將TdT酶稀釋2-5倍后再按照說明書操作，稀釋后的ToT 酶僅供當日使用。

（3）處于高速分裂和增殖狀態中的細胞，有時也會出現細胞核中的DNA 斷裂。建議：在非高增殖期取樣檢測.

（4）有些試劑或細胞存在自發熒光，選擇染料時要避開自發熒光的顏色。

（5）DAB孵育時間過長，減少DAB染色時間。

（6）Biotin-X-dUTP的非特異性結合，在 TdT酶反應之后，再用含0.1% Triton X-100和1mg/ml BSA的 PBS洗三次。

5. 標記率低？

（1）乙醇、甲醇或甲醛(市面上購買的甲醛大多含有甲醇)固定的樣品標記效率較低(因為在固定時染色質未能與蛋白質交聯，而在操作中丟失)，采用推薦的固定液。

（2）固定時間過長，導致交聯程度過高，減少固定時間。

（3）貼壁細胞如果使用藥物誘導凋亡，會細胞皺縮，貼壁黏附力降低，導致凋亡細胞容易脫落。建議：在凋亡誘導結束后，可以對多孔板進行1000g離心5min，然后再吸出培養基并用PBS洗滌。如果沒有適合的離心機，請注意操作輕緩，防止發生凋亡的細胞在洗滌時被洗去。后續整個操作也需要輕緩。